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B.从组织中分离线粒体:
1)
使用新鲜的动物组织,通常要求动物处死后不超过一小时,并且保存在冰上的组织。请勿使用经过冷冻保存的组织。
2)
剪取一小块组织,重里约为50-100 mg。在1.5 ml离心管内对剪取的组织进行称重。用PBS洗涤组织一次。
3) 把组织放在一个置于冰上的离心管或培养皿中,用剪刀或刀片把组织剪切成非常细小的组织碎片。
4) 加入10体积预冷的线粒体分离试剂A或临用前添加了1:100稀释的酶抑制剂的线粒体分离试剂A,在冰浴上进行匀浆,匀浆10次左右。
注:如果组织的重里为50 mg,可以大致认为组织的体积接近50μl,此时需加入500μl线粒体分离试剂A。
5) 把匀浆在600g,4℃离心5 min。
注:如需获得纯度更高的线粒体,可以将此步骤的离心速度改为1000g,其它离心条件不变;获得更高纯度线粒体的缺点是相同数量细胞的线粒体抽提
得率会下降。
6) 小心把上清转移到另一离心管中,在11000 g,4℃离心10 min。
注:如需获得纯度更高的线粒体,可以将此步骤的离心速度改为3500g,其它条件不变:获得更高纯度线粒体的缺点是相同数里细胞的线粒体抽提得率
会下降。
7) 小心去除上清。沉淀即为分离得到的线粒体。
注:如果希望获得去除线粒体的细胞浆蛋白,在本步骤需收集上清,并且在收集上清时注意勿触及沉淀。随后把收集的上清12000g,4℃离心10min。取
上清即为去除线粒体的细胞浆蛋白。
8) 如果用于线粒体的蛋白分析,初始重量为50-100mg的组织样品分离得到的线粒体样品中可以加入150-200μ临用前添加了1:100稀释的酶抑制
剂的线粒体裂解液裂解线粒体。裂解后的线粒体可以用于PAGE、Western、IP以及线粒体中的一些酶活性的测定等。裂解后的蛋白样品可以使用BCA法测
定蛋白浓度。
9)
如果用于双向电泳,请使用适当的用于双向电泳的裂解液处理线粒体。
