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二、筛选稳定转染细胞系

转染细胞,用100mm培养皿进行培养。以未转染的细胞作为阴性对照。

转染后,用预热的1X PBS洗涤一次,加入新鲜培养基。

转染48-72h后,用含有Zui加浓度Zeocin(由灭杀曲线确定)的新鲜培养基筛选细胞。为了更好的鉴定和筛选细胞集落,建议将细胞按比例稀释成一系列浓度。

【注】:若待筛选细胞对Zeocin的抗性明显强于大部分细胞,按照以下方法克服此类耐性:用含Zeocin培养基进行细胞分盘,置于37°C孵育2-3h,使得细胞贴壁。然后将细胞置于4°C,2h。记得使用Hepes作为培养基的缓冲体系。重新将细胞置于37°C孵育。4°C孵育细胞的目的是短时间内终止细胞分化,使得Zeocin能发挥作用,杀死细胞。

每3-4天更换新鲜的选择培养基,直到出现细胞集落。

挑选并转移克隆到96或48孔板中。在进行更大孔径培养板或培养皿上扩大培养之前,确保培养细胞密度近 。